Yupqa otning genetik kelib chiqishi va tezligining tarixi | Tabiat bilan aloqa

Chinnigullar poygasi otining tezligining genetik kelib chiqishi va tarixi

Chavandoz otlarida tezlik uchun selektsion naslchilik, tez yugurish poygasi uchun eng mos bo'lgan, toza zotli otlar kohortlarida mostatin genida (MSTN) C-variantining (g.66493737C/T) g'ayrioddiy yuqori chastotasiga olib keldi. Bu erda biz Evroosiyo va Shimoliy Amerikadagi 22 ot populyatsiyasidan 593 otda molekulyar va naslchilik asosidagi yondashuvlar kombinatsiyasini, tarixiy ahamiyatga ega 12 zotli ayg'oq (muzey namunalari 1764–1930), 330 elita-zamonaviy zamonaviy zotli zotlardan va T-allelning ajdodlari bo'lgan va ingliz aslidan bo'lgan zotli zotning boshlang'ich bosqichida C allelining yagona kiritilishi bo'lgan boshqa uchta teng turdagi 42 ta namuna. Bundan tashqari, biz shuni ko'rsatadiki, C-allel 18-19-asrlarning mashhur otlari orasida kamdan-kam uchraydi.yaqinda populyatsiyada hozirgi zamonning eng nufuzli ayoli Shimoliy raqqos (b.1961) Nearctic (1954 y.) ayig'i orqali ko'paygan. Horsemyostatingenning genetik o'zgarishi eng yaxshi zotli sprinterlarda juda yuqori chastotada uchraydi. Tadqiqot shuni ko'rsatadiki, zamonaviy va tarixiy otlarning molekulyar va naslli ma'lumotlaridan foydalangan holda, bu variantning yagona joriy etilishi ingliz zotidan olingan zotli naslning boshlang'ich bosqichida sodir bo'lgan.Variantning yagona kiritilishi ingliz asli ingichka zotli naslli naslning asoslanish bosqichlarida ro'y bergan.Variantning yagona kiritilishi ingliz asli ingichka zotli nasldan naslga o'tish bosqichida sodir bo'lgan.
08.09.2021

Chopqir ot tezlikni uchun selektsiya da C-rivoyatda (g.66493737C / T) bir ayniqsa yuqori chastotali olib keldi myostatin(gen MSTN) yugurish poygasiga eng mos bo'lgan, zotli otlar kogortlarida. Bu erda biz Evroosiyo va Shimoliy Amerikadagi 22 ot populyatsiyasidan 593 otda molekulyar va naslchilik asosidagi yondashuvlar kombinatsiyasini, tarixiy ahamiyatga ega 12 zotli ayg'oq (muzey namunalari 1764–1930), 330 elita-zamonaviy zamonaviy zotli zotlardan va T-allelining ajdodlari bo'lgan va ingliz asli bo'lgan ingichka zotning asosli bosqichlarida C-allelining yagona kiritilishi bo'lgan boshqa uchta teng turdagi 42 ta namuna. Bundan tashqari, biz shuni ko'rsatadiki, C-allel 18-19-asrlarning mashhur yuguruvchi otlari orasida kamdan-kam uchragan bo'lsa-da, u yaqinda populyatsiyada zamonaviy zamonaning eng nufuzli otining otasi Nearctic (1954 y.) Ayig'i orqali ko'paygan. , Shimoliy raqqosa (1961 yil tug'ilgan).

Kirish

Chiroyli zot - dunyodagi eng qimmat ot zoti va asrlar davomida poyga oti sifatida qadrlangan. 17 -asrda ingliz zodagonlarining poygaga bo'lgan ishtiyoqi "zotli zot" ning rivojlanishiga olib keldi va bugungi kunda barcha zamonaviy zotli a'zolar o'zlarining nasl -nasabini uchta arab, barb va turk kelib chiqishi va 74 mahalliy ingliz va chetdan olib kelingan ayg'oqlardan kelib chiqadi. Mares 2, 1791 yilda Umumiy kitobga yozilgan (3 -havola). Zotning 300 yillik rivojlanishi mobaynida, zotli zotlarni sportning fenotiplari uchun tanlab olishdi, bu esa irqlarning 4-turida yuqori poyga poligonining ishlashini ta'minlaydi. Buyuk Britaniyada va Irlandiyada poyga uslubi turli xil yugurish otlarini - erta, tez, 2 yoshli va yuguruvchilarni ko'paytirishni qo'llab -quvvatladi.O'rta masofadagi klassik otlar va chidamliligi yuqori bo'lgan otlar.

Atletik fenotiplarga atrof -muhit, boshqaruv va mashg'ulotlar katta ta'sir ko'rsatadi; ammo, otning sport qobiliyatiga ta'sir etuvchi asosiy genetik omillar borligi uzoq vaqtdan beri qabul qilingan 5. Haqiqatan ham, poyga otlarini tanlash va ko'paytirish, poyga yurishi meros bo'lib o'tishiga ishonishga asoslanadi. Garchi zo'ravonlik 6,7,8,9,10,11,12,13 uchun elita atletizm va jismoniy mashqlarga fiziologik moslashuvlar yaxshi tasvirlangan bo'lsa -da, 14,15,16 bu xususiyatlarni tushuntiradigan kam sonli genlar aniqlangan. Odamlarda 200 dan ortiq genlar fitnes bilan bog'liq sog'liq va jismoniy mashqlar 17 bilan bog'liqligi haqida xabar berilgan, va, ehtimol, zotli poygada poyga ko'rsatkichlari ham poligen bo'lib, anatomikaning keng doirasiga hissa qo'shadigan genlar ta'sirida bo'lishi mumkin.Metabolik va fiziologik moslashuvlar, bu elita-poyga ishlashini ta'minlaydi. Yugurgan otning sport salohiyati qulay muhitga bog'liq bo'ladi, shuningdek, mashqlarga sezilarli ta'sir ko'rsatadigan lokuslarda DNK variantlarining optimal kombinatsiyasini meros qilib oladi.

So'nggi paytlarda, MSTNlokusidagi o'zgarish 18,19,20,21 zotli irqiy otlarda irqiy masofaga moyillik uchun genetik potentsialni yuqori darajada bashorat qilgani aniqlandi va boshqa ot zotlarining morfologik turiga 22 ta hissa qo'shdi. MSTNturar joy birinchi Intro joylashgan darrandalar turlaridan 23,24,25,26,27 va bitta nukleotid polimorfizm (SNP, g.66493737C / T) bir qator mushak gipertrofiyasi fenotipleri bilan bog'liq MSTNTo'qimachilik jinsida gen tezlikka ta'sir qiladi 19. Yaxshi zotli homozigotli C/C otlari tez, qisqa masofaga yugurish uchun eng yaxshi mos keladi (1000–1600 m); geterozigotli C/T otlar o'rta masofalarga yugurishlarda (1400–2400 m) yaxshi raqobatlashadi; va gomozigotli T/T otlar ancha chidamli (>2000 m). Yugurish yo'llarining retrospektiv ko'rsatkichlari, jismoniy o'sishi va ayg'oq nasllari ko'rsatkichlari shuni ko'rsatdiki, C/C va C/T otlari jismoniy jihatdan ancha erta bo'lib, T/T otlariga qaraganda 2 yoshli poyga otlari kabi katta poyga poygasida muvaffaqiyat qozonishadi. . Keyinchalik bu topilmalar Irlandiya, Buyuk Britaniya, Yangi Zelandiya, AQSh, 18 va Yaponiyada tug'ilgan zotli jinslar populyatsiyasida o'tkazilgan uchta mustaqil genom assotsiatsiyasi (GWA) 18,20,21 tadqiqotlarida tasdiqlandi. Yagona,eng yaxshi poyga masofasiga genomik ta'sirChiroyli zotli MSTNlokuslari irq masofasi uchun yuqori irsiyatbilan quvvatlanadi ( h2 = 0.94) 29. C-allelini o'z ichiga olgan xromosomalarning tezlikka ta'sir qilishidagi rolini isbotlovchi dalillar tezlik indekslari 30 bilan assotsiatsiya testlari va chorak otidagi g.66493737C/T genotiplarining oldingi tahlilidan kelib chiqadi. C homozigotlari (0,83) haqida xabar berilgan 19. Chorak ot-chorak mil (400 m) yoki undan kamroq masofalarga yugurish bo'yicha ustun bo'lgan Shimoliy Amerika zoti. Qisqa masofalarga yugurishdagi o'ziga xosligi tufayli, bu zot 1800-yillarning o'rtalarida paydo bo'lganidan beri tezlik uchun kuchli tanlovdan o'tdi.

Funktsional kontekstda mRNK transkriptlari MSTNdanolinganlokus 2 yoshli 32 yoshida mashg'ulotning birinchi yilidan so'ng, oqsoqollar skelet mushaklarining transkriptomasida ifoda etishdagi eng katta o'zgarishlarga ega va mRNK ifodasining o'zgarishi 33 -genotip bilan chambarchas bog'liq. Garchi g.66493737C varianti taxminiy transkripsiya faktorini bog'lovchi saytni buzsa -da, u funktsional variantni anglatadimi -yo'qmi noma'lum. Biroq, g.66493737C/T SNPni o'rab turgan 50-bp ketma-ketligi ot va odam o'rtasida saqlanib qolgan va 200-bp 5 'va 3' yonboshli ketma-ketlikda minimal farq bor (mos ravishda 5 va 1,25%). Promoter mintaqasi ketma-ketligida 227-bp SINE qo'shish polimorfizmining (Ins227bp) mavjudligi ham taxminiy funktsional variant deb qaralishi mumkin va bu ikki polimorfizm o'rtasidagi bog'liqlik muvozanati yuqori ( r)2 = 0,73), lekin to'liq emas 20. G.66493737C/T va Ins227bp variantlari oqsilli populyatsiyada polimorfik; ammo, Evropa ot zotlari populyatsiyasini o'z ichiga olgan qayta tartiblash ishida, g.66493737C/T SNP polimorf bo'lmagan (kichik allel chastotasi (MAF)

Garchi g.66493737C/T xilma -xilligi zo'ravonlarda yaxshi tavsiflangan bo'lsa -da, bu polimorfizmning kelib chiqishi va tarixi noma'lum. Shuning uchun, biz bu erda iqtisodiy jihatdan qimmatli allelning nasl-nasab otidan kelib chiqishini aniqlash uchun zamonaviy va tarixiy ot namunalarida populyatsiya genetikasiga asoslangan molekulyar va naslchilik usullarining kombinatsiyasidan foydalanamiz.

Natijalar

Genetik kelib chiqishi va geografik tarqalishi

G.66493737C/T allelini tenglikda aniqlash uchun biz SNP ni n= 40 eshak ( Equus asinus) va ikkita zebrada( Equus grevyiva Equus quagga boehmi) genotip qildik. Hech qanday eshak yoki zebra xromosomasida ( 2n= 84) g.66493737C varianti bo'lmaganligi sababli, biz T-allelining ajdodlardan bo'lgan yovvoyi tur ekanligini aniqladik. Bu yovvoyi tekisliklarga to'g'ri keladi-34 ta keng diapazonda katta masofalarni bosib o'tadigan teng populyatsiyalar. Keyinchalik, C-allelining mumkin bo'lgan manba populyatsiyasini aniqlash uchun biz genotiplarning geografik taqsimlanishini n =17 ta populyatsiyadan 394 chiniqsiz Evrosiyo otlari genotiplash uchun tanlangan, ular ingichka zotli asosli populyatsiyalarni (Britaniya orollari ingliz va irland otlarini, Yaqin Sharq va Shimoliy Afrikani arab, barb va turk ta'sirini ifodalaydi) 35 va aholi joylashgan. ot uchun uy sharoitining geografik markazida (Osiyo) 36,37. Har xil raqobat bosimi bo'yicha so'nggi tanlovning ta'sirini baholash uchun biz bu ma'lumotni yaqinda olingan to'rtta zotli genotiplar bilan taqqoslab ko'rdikki, ular "zotli", ya'ni frantsuz Trotter: jabduqlar poygasi; irlandiyalik shashka otlari: ko'rgazmali sakrash va yugurish; chorak ot: sprint poygasi. ; Standardbred: jabduqlar poygasi), shuningdek, geografik va genetik jihatdan ajratilgan otlar populyatsiyasi bilan (Islandiya).Biz aniqladikki, C-allel zotli zotda 0,51 chastotada uchraydi, Evroosiyo otlarida 0,00 dan 0,50 gacha bo'lgan chastotalarda uchraydi (Britaniya orollari, Yaqin Sharq, Shimoliy Afrika va Osiyo), Standardbredsda yo'q va eng keng tarqalgan. chorak ot (0,90). Shuning uchun C-allel faqat zotli va oqsilli populyatsiyalar bilan chegaralanmagan, yangi mutatsiya emas va populyatsiyadagi tanlov bosimiga qarab o'zgaruvchan chastotalarda ro'y beradi (1-jadval). Qisqichbaqasimonlar va chorak otlar poygasida C-allelining yuqori chastotasidan farqli o'laroq, C/C genotipi Osiyoning atigi 4 foizida, Yaqin Sharq va Shimoliy Afrikaning 3 foizida va Britaniya orollarining 20 foizida tanlangan.Yaqin Sharq va Shimoliy Afrika va Osiyo), Standardbredsda yo'q va ko'pincha chorak otda uchraydi (0,90). Shuning uchun C-allel zotli va oqsilli populyatsiyalar bilan chegaralanmagan, yangi mutatsiya emas va populyatsiyadagi tanlov bosimiga qarab o'zgaruvchan chastotalarda paydo bo'lgandek tuyuladi (1-jadval). Qisqichbaqasimonlar va chorak otlar poygasida C-allelining yuqori chastotasidan farqli o'laroq, C/C genotipi Osiyoning atigi 4 foizida, Yaqin Sharq va Shimoliy Afrikaning 3 foizida va Britaniya orollarining 20 foizida tanlangan.Yaqin Sharq va Shimoliy Afrika va Osiyo), Standardbredsda yo'q va ko'pincha chorak otda uchraydi (0,90). Shuning uchun C-allel faqat zotli va oqsilli populyatsiyalar bilan chegaralanmagan, yangi mutatsiya emas va populyatsiyadagi tanlov bosimiga qarab o'zgaruvchan chastotalarda ro'y beradi (1-jadval). Qisqichbaqasimonlar va chorak otlar poygasida C-allelining yuqori chastotasidan farqli o'laroq, C/C genotipi Osiyoning atigi 4 foizida, Yaqin Sharq va Shimoliy Afrikaning 3 foizida va Britaniya orollarining 20 foizida tanlangan.va populyatsiyadagi tanlov bosimiga qarab o'zgaruvchan chastotalarda ro'y beradi (1 -jadval). Qisqichbaqasimonlar va chorak otlar poygasida C-allelining yuqori chastotasidan farqli o'laroq, C/C genotipi Osiyoning atigi 4 foizida, Yaqin Sharq va Shimoliy Afrikaning 3 foizida va Britaniya orollarining 20 foizida tanlangan.va populyatsiyadagi tanlov bosimiga qarab o'zgaruvchan chastotalarda ro'y beradi (1 -jadval). Qisqichbaqasimonlar va chorak otlar poygasida C-allelining yuqori chastotasidan farqli o'laroq, C/C genotipi Osiyoning atigi 4 foizida, Yaqin Sharq va Shimoliy Afrikaning 3 foizida va Britaniya orollarining 20 foizida tanlangan.

Chinnigullar 1791 yildan beri yopiq populyatsiya bo'lgani uchun (ref. 3), C-allel zotning boshlang'ich bosqichlarida (17-asr boshidan o'rtalariga) joriy qilingan bo'lishi kerak. Ta'sis paytida yuqori chastotali allellar past chastotali namunalarga qaraganda ko'proq tanlanadi. Umuman olganda, C-allel chastotalari Evroosiyo populyatsiyalarida past bo'lgan va asosan heterozigotli holatda saqlanib qolgan (1-jadval). Biroq, taxmin qilinadigan manba populyatsiyalari (Britaniya orollari, Yaqin Sharq va Shimoliy Afrika) orasidagi allellarning chastotalarini baholashda C-allellarining nisbatan yuqori chastotali ikki populyatsiyasi aniqlandi (Fulani, 0.33; Shetland 1, 0.50). Afrikalik otlar (Kamerunda namuna qilingan Fulani) va oqsoqollar o'rtasidagi bog'liqlik aniq, chunki Shimoliy Afrikada tug'ilgan Barb oti,Chinnigullar 38 ning paydo bo'lishiga hissa qo'shgani ma'lum. Shuningdek, yaqinda o'tkazilgan otlarning mitoxondriyal DNK o'zgarishini tahlil qilish shuni ko'rsatdiki, ingichka zotli yirik quyonlarning katta qismi Buyuk Britaniyaning 35 aktsiyasidan bo'lgan. Shetland (hech bo'lmaganda geografik jihatdan) Galloway zoti bilan chambarchas bog'liq, u ingliz poygachi populyatsiyasi bo'lib, ingichka zotli zotning rasmiy asosi 39,40 ga qadar bo'lgan. Osiyoda, mo'g'ul populyatsiyalaridan birida (Mo'g'uliston 1) tanlangan C-allellarning (0,44) nisbatan yuqori chastotasi noaniq, ammo qarindoshlarning bila turib tanlanishi bilan izohlanishi mumkin. Bu bir xil mintaqadagi otlarning ikkita qo'shimcha populyatsiyasini (mo'g'ul gobi va mo'g'ulcha 2) qayta namuna olish orqali qo'llab-quvvatlanadi, ular ichida C-allel kamdan-kam uchraydi (mos ravishda 0,10 va 0,03) va homozigotli C/C otlari yo'q (Yaqinda o'tkazilgan mitoxondriyal DNKning o'zgarishi tahlillari shuni ko'rsatdiki, oqsoqollarning asosiy qismi Buyuk Britaniyaning 35 aktsiyasidan bo'lgan. Shetland (hech bo'lmaganda geografik jihatdan) Galloway zoti bilan chambarchas bog'liq, u ingliz poygachi populyatsiyasi bo'lib, ingichka zotli zotning rasmiy asosi 39,40 ga qadar bo'lgan. Osiyoda, mo'g'ul populyatsiyalaridan birida (Mo'g'uliston 1) tanlangan C-allellarning (0,44) nisbatan yuqori chastotasi noaniq, ammo qarindoshlarning bila turib tanlanishi bilan izohlanishi mumkin. Bu bir xil mintaqadagi otlarning ikkita qo'shimcha populyatsiyasini (mo'g'ul gobi va mo'g'ulcha 2) qayta namuna olish orqali qo'llab-quvvatlanadi, ular ichida C-allel kamdan-kam uchraydi (mos ravishda 0,10 va 0,03) va homozigotli C/C otlari yo'q (Yaqinda o'tkazilgan mitoxondriyal DNKning o'zgarishi tahlillari shuni ko'rsatdiki, oqsoqollarning asosiy qismi Buyuk Britaniyaning 35 aktsiyasidan bo'lgan. Shetland (hech bo'lmaganda geografik jihatdan) Galloway zoti bilan chambarchas bog'liq, u ingliz poygasi populyatsiyasi bo'lib, ingichka zotli zotning rasmiy asosi 39,40 ga qadar bo'lgan. Osiyoda, mo'g'ul populyatsiyalaridan birida (Mo'g'uliston 1) tanlangan C-allellarning (0,44) nisbatan yuqori chastotasi noaniq, lekin qarindoshlarning bila olmasliklari bilan izohlanishi mumkin. Bu bir xil mintaqadagi otlarning ikkita qo'shimcha populyatsiyasini (mo'g'ul gobi va mo'g'ul 2) qayta namuna olish orqali qo'llab-quvvatlanadi, ular ichida C-allellari kamdan-kam uchraydi (mos ravishda 0,10 va 0,03) va homozigotli C/C otlari yo'q (mos ravishda) va homozigotli C/C otlari yo'q (mos ravishda) va gomozigotli C/C otlari yo'q (mos ravishda) va gomozigotli C/C otlari yo'q (mos ravishda) va homozigotli C/C otlari yo'q (ingliz poygachi populyatsiyasi bo'lgan, bu zotdor zotning rasmiy asosi 39,40. Osiyoda, mo'g'ul populyatsiyalaridan birida (Mo'g'uliston 1) tanlangan C-allellarning (0,44) nisbatan yuqori chastotasi noaniq, lekin qarindoshlarning bila olmasliklari bilan izohlanishi mumkin. Bu bir xil mintaqadagi otlarning ikkita qo'shimcha populyatsiyasini (mo'g'ul gobi va mo'g'ul 2) qayta namuna olish orqali qo'llab-quvvatlanadi, ular ichida C-allellari kamdan-kam uchraydi (mos ravishda 0,10 va 0,03) va homozigotli C/C otlari yo'q (ingliz poygachi populyatsiyasi bo'lgan, bu zotdor zotning rasmiy asosi 39,40. Osiyoda, mo'g'ul populyatsiyalaridan birida (Mo'g'uliston 1) tanlangan C-allellarning (0,44) nisbatan yuqori chastotasi noaniq, ammo qarindoshlarning bila turib tanlanishi bilan izohlanishi mumkin. Bu bir xil mintaqadagi otlarning ikkita qo'shimcha populyatsiyasini (mo'g'ul gobi va mo'g'ul 2) qayta namuna olish orqali qo'llab-quvvatlanadi, ular ichida C-allellari kamdan-kam uchraydi (mos ravishda 0,10 va 0,03) va homozigotli C/C otlari yo'q (Bu bir xil mintaqadagi otlarning ikkita qo'shimcha populyatsiyasini (mo'g'ul gobi va mo'g'ulcha 2) qayta namuna olish orqali qo'llab-quvvatlanadi, ular ichida C-allel kamdan-kam uchraydi (mos ravishda 0,10 va 0,03) va homozigotli C/C otlari yo'q (Bu bir xil mintaqadagi otlarning ikkita qo'shimcha populyatsiyasini (mo'g'ul gobi va mo'g'ulcha 2) qayta namuna olish orqali qo'llab-quvvatlanadi, ular ichida C-allel kamdan-kam uchraydi (mos ravishda 0,10 va 0,03) va homozigotli C/C otlari yo'q (n= 55) namuna olindi. Mo'g'ul otlarini zotli zotlarning bevosita manbai sifatida aniqlashning tarixiy asoslari kam yoki umuman yo'q.

Haplotipning xilma -xilligi va aholi manbai

Asosiy bosqichlarda C-allelli introgressiya darajasini aniqlash uchun biz 46 ta SNP (BIEC2-417187-) uchun n= 204 C-xromosomalarda va n= 160 T-xromosomalarda faqat C/C va T/T gorofbridlarida haplotiplarni rekonstruksiya qildik. BIEC2-417520) EquineSNP50 Genotyping BeadChip (Illumina, San-Diego, Kaliforniya, AQSh) va g.66493737C/T variantidan olingan. 47 SNP-haplotiplari (1a-rasm) MSTNgen lokusida 1.9-Mb hududini qamrab olgan bo'lib, unda genom miqyosidagi assotsiatsiyaning oldingi genom assotsiatsiyasida o'tkazilgan 20 tadqiqotida eng yaxshi irqiy masofaga ega bo'lgan sakkizta SNP to'plami mavjud. C-allel 932 kb hajmli bitta haplotipik fonda kuzatilgan (ya'ni BIEC2-417299 va BIEC-417453 o'rtasida hech qanday o'zgarish aniqlanmagan; ECA18: 66064660–66996871 bp; n= To'liq zotlarda MAF>0.05 da bo'lgan 17 ta SNP; Qo'shimcha ma'lumotlar 1, TB_C1) va g.66493737C/T SNP oqimining yuqorisidagi bitta proksimal mintaqada (1 -blok) faqat minimal o'zgarish aniqlandi (1b -rasm). Bundan farqli o'laroq, T-allel murakkab genetik fonda vujudga keladi, bu mintaqada bir nechta haplotip bloklari va g.66493737C/T SNP ni o'z ichiga olgan haplotip blokida (4-blok, 484 kb gacha) sezilarli o'zgarish (1c-rasm). . Hammasi bo'lib, 932 kb blokli T-xromosomalari orasida C allel atrofida o'zgarmas 10 ta haplotip aniqlandi (Qo'shimcha ma'lumotlar 1, TB_T1 – TB_T10). Chiroyli C-allelining manbasini aniqlashga urinishda , Shetland namunalarining ikkinchi to'plami (Shetland 2; n) uchun haplotiplar ( MAF>0,05 bo'lgan n= 9 SNP) rekonstruksiya qilindi.= 42; C/C, 0,29; C/T, 0,40; T/T, 0.31) va oqsilli xromosoma fonlari bilan solishtirganda. N= 26 T-xromosomalar (ya'ni T/T, n =13) orasida 16 ta haplotip (Qo'shimcha ma'lumotlar 1, Shet_T1 – Shet_T16) aniqlangan . Bundan farqli o'laroq, Shetland C-xromosomalari orasida to'rt haplotip aniqlandi (C/C, n= 12; Qo'shimcha ma'lumotlar 1, Shet_C1 – Shet_C4; Shet_C1 chastotasi = 0,456; Shet_C2 = 0.086; Shet_C3 = 0.414; Shet_C4 = 0.044). Shet_C3 Thoroughbredsda kuzatilgan C-xromosoma haplotipiga juda o'xshash edi; 750 kb sig'adigan 17 ta SNPning 16 tasi (ya'ni, BIEC2-417453 ning 178 kb proksimal variantini hisobga olmaganda), sof S-xromosomalaridagi o'zgarmas mintaqa bilan bir xil edi. Bu ma'lumotlar birgalikda inglizlarning mahalliy oti tomonidan kiritilgan zotli zotning asos bosqichida C-allelining yagona kiritilishiga mos keladi. Fulani (yoki Shimoliy Afrikaning boshqa vakillari) uchun haplotip ma'lumotlarining yo'qligi, C-allelining Barb kelib chiqqan ayg'ir yoki quyondan kelib chiqishi ehtimolini rad etadi, lekin bu ehtimoli kamroq.

Bir 1,9-Mb mintaqani yoyilgan o'zaro aloqasi, disequilibria ning Haploview vakillik MSTNThoroughbred otlarga gen lokusu. 47 ta SNPning bog'lanish muvozanati tuzilishi ( a) Barcha zotli zotli ( n= 397) ( b) C/C Faqat toza zotli ( n= 102) va ( c) T/T Faqat zotli ( n= 80) uchun ko'rsatilgan. Bloklar ishonch oralig'i usuli yordamida aniqlandi. SNP identifikatori diagrammaning yuqori qismida ko'rsatiladi. Ranglar D'qiymatini ifodalaydi (to'q qizil = yuqori SNP D'; ko'k = statistik jihatdan noaniq D'; oq = past SNP D') va rBloklar ichida 2 ta qiymat mavjud (qalin = yuqori r2). To'liq zotli hayvonlarda C allel 932 kb hajmli bitta haplotipik fonda kuzatilgan; T-allel 10 haplotipik fonda kuzatilgan.

Tarixiy manba

C-allelining tarixiy manbasini aniqlash uchun biz 1764 yildan 1930 yilgacha tug'ilgan tarixiy muhim zotli ayg'oqlarning 12 ta muzey (va shaxsiy kolleksiya) namunalaridan olingan g.66493737C/T o'zgarishini tahlil qildik (2-jadval). Barcha tarixiy namunalar T-allel uchun homozigot edi. Muhimi, ilgari ushbu namunalarda boshqa genomik lokuslarning o'zgarishi kuzatilgan, bu shuni ko'rsatadiki, bu SNPdagi homozigotlik namunalarning yoshiga bog'liq artefakt bo'lishi dargumon. Vaqt o'tishi bilan mustaqil namuna olish va T- va C-allellarning nisbiy chastotalari o'zgarmasligini hisobga olsak, n =12 T/T genotipini kuzatish ehtimoli.12 ta namuna to'liq zoti juda past (7,35 × 10-9). Shu bilan birga, tarixiy namunalarda allellarning mustaqil namunalarini olish mumkin emas edi, chunki bu otlar o'rtasida yaqinlik darajasi yuqori edi (2 -rasm). 17 -asr oxiri - 18 -asr boshlarida Angliyaga olib kelingan uchta ayg'irni otalik izidan topadilar: Byerli Turk (1680 -yillar), Darli Arabian (1704) va Godolphin Arabian (1729). Bundan tashqari, oz sonli ayg'oqlar erta Klassik poygalarga nomutanosib ta'sir ko'rsatdilar, natijada ular 4 -chi studiyada mashhurlikka erishdilar. Shuning uchun, oqsoqollar genofondini otaning afzalligi va tanlovi natijasida kichik poydevor zaxiralari va keyinchalik cheklangan otalik hissalari cheklab qo'ydi. Tarixiy namunalar, asosan, Darley Arabiya otasi liniyasi orqali bog'liq edi (2 -rasm).2) barcha tirik oqsoqollarning 95% ni otalik naslidan kuzatish mumkin. Tarixiy ma'lumotlarda na Bayerli turklari, na Godolphin Arabian sere liniyalaridan namuna olinmaganligi sababli, biz ularni C-allel manbai sifatida istisno qila olmaymiz. Biroq, Darley arabi tirik erkaklar nasl-nasabiga nomutanosib ta'sir ko'rsatgan va shuning uchun bu qimmatbaho ayg'oq namunasida haddan tashqari ko'p ko'rsatilgan, ehtimol, C-allel zotli nasl-nasab orqali zotli genofondga kirgan.ehtimol, C-alleli oqsilli genofondga ona nasli orqali kirgan.ehtimol, C-allelining nasl-nasabli naslli genofondiga kirgan.

Tarixiy ahamiyatga ega bo'lgan 12 zotli ayg'oq o'rtasidagi naslchilik munosabatlari b. 1764-1930 yillar.

Zo'r naslli yozuvlar uy hayvonlari zotlari o'rtasidagi ajdodlar munosabatlarini batafsil bayon etuvchi eng keng qamrovli yozuvlar sifatida qaraladi va rasmiy ravishda 1791 yildan boshlab katalogga kiritiladi (ref. 3). Shuning uchun, nasl-nasabga asoslangan yondashuvdan foydalanib, biz n= 56 elita ishlaydigan C/C va nuchun naslchilik munosabatlarini tikladik.= C va T allellari uchun birlashish nuqtalarini aniqlashga urinib, 41 ta elita ijro etuvchi T/T oqsoqollar 19,20. C/C va T/T kogortalari uchun yagona umumiy ajdod aniqlandi (Qo'shimcha rasm S1). Nearco (1935 y.t.) 20-asrning eng yaxshi uchta yuguruvchi oti va otasi hisoblanadi va 1900-yillarning o'rtalarida 42-chi chorvachilikda ustunlik qilgan. Nearkoning uchta o'g'li taniqli ayg'irlar edi (Nasrullah, Nearctic va Royal Charger) va Nasrulloh "yuqori darajali tezlikning kuchli manbai" 42 sifatida tasvirlangan. Nasrulloh va Qirol Zaryadlovchining urg'ochi nasl -nasabi, shuningdek, "zo'ravonlik" tezligining kelib chiqishi haqidagi sharhlarda ham mashhur bo'lgan, chunki ular Mumtoz Mahalning (navbati bilan ikkinchi va uchinchi to'g'on) avlodlari, ular "Uchar bo'r" laqabli.va 42 yoshli 2 yoshli eng yuguruvchi ot sifatida tan olingan. Nearctic shimoliy raqqosning otasi edi, zamonaviy davrning eng muhim otalaridan biri. Biz aniqladikki, C/C otlarining nisbati T/T otlariga qaraganda Nearktikaga to'g'ri keladi (mos ravishda 87,5 va 68,3%; Fisherning aniq testi; ikki dumli:P =0,025), lekin C/C va T/T otlarining ajdodlarida Nearco-dan boshqa ayg'irlarning paydo bo'lishida sezilarli farq yo'q edi.

Muhokama

MSTNlokusining o'zgaruvchanligi, zo'ravonlardapoyga fenotiplariga, ayniqsa, skelet mushaklarining erta rivojlanishiga va qisqa masofalarga yugurish qobiliyatiga ta'sir ko'rsatishi aniqlandi. O'tgan asrdagi poygalardagi o'zgarishlar MSTNnishakllantirdivaqt va turli poyga mintaqalarida genotiplarning tarqalishi. XVII va XVIII asrlarda poygalar ikki ot o'rtasida bir necha marta qizib ketadigan, 3200-6400 m masofada yugurish shakliga kirgan va ot ikki marta g'olib bo'lgunga qadar yoki raqibni "uzoqlashtirgan" paytgacha takrorlangan. . Otlar 5-6 yoshgacha, keyin esa hayotlarida atigi ikki yoki uch marta poyga qilmagan. Bu o'ziga xos demografiya T/T genotipining o'sha paytdagi mashhur otlar orasida tarqalishini qo'llab -quvvatlagan bo'lar edi. 1700 -yillarning oxiri va 1800 -yillarning boshlarida ingliz klassik musobaqalarining asosi poygada o'zgarish bo'ldi, natijada 1600 m (1000 va 2000 Gvineya) - 2800 m (Sankt -Leger) oralig'ida yugurishga qodir otlar tanlandi. 3 yildan.Yosh otlar uchun poygalar tobora ommalashib bordi va yosh otlar musobaqalashar ekan, poygalar qisqarib ketdi. 1860-yillarning oxiriga kelib, issiqlik poygalari deyarli butunlay yo'q bo'lib ketdi va 100 yildan ortiq vaqt mobaynida 4 millik tekis poygalar bo'lmagan. 2 yoshli poygalar tobora ommalashib borayotgani sababli, tezlik va tezlik bo'yicha mukofot oshdi. 1802 yilda 2000 m masofadagi musobaqalar cheklangan (9% AQSh, 23% Avstraliya, 28% Britaniya) va Avstraliyada 1 -guruh poygalarining 37% 1000-1400 m masofalarda o'tkaziladi. AQShda 20% va Britaniyada atigi 12%.Bu tanlov bosimi genotiplarning tarqalishida aks etadigan C-allellarning ko'payishiga yordam beradi.n= 123; C/C, 0.38; C/T, 0.51; T/T, 0.11) avstraliyalik elita maralari va ayg'irlari namunasi orasida.

Bizning populyatsion genetik tadqiqotlarimiz zotning dastlabki pog'onalarida zotli C-allelining bir marta kiritilishiga mos keladi va ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, S-allelining zo'r zotli populyatsiyasi mahalliy ingliz populyatsiyasi bo'lgan. Bundan tashqari, C-allel ayol jinsi orqali kirgan bo'lishi mumkin, chunki qimmatbaho poydevorli ayg'irlar (17-18-asrlar) T-allel uchun homozigot edi. Biroq, populyatsiyada qulay allellarni ko'paytirish imkoniyati ko'p bolali mashhur ayg'irlar orasida katta bo'ladi. Birlashuvni tahlil qilish shuni ko'rsatadiki, zotli zotda C-allel chastotasini ko'paytirish imkoniyati yaqinda (20-asrda) Nearctic va uning o'g'li Shimoliy raqqosa orqali paydo bo'lgan.Bu ma'lumotlar tarixiy kuzatuvlarga mos keladi va uy hayvonlari populyatsiyasida intensiv sun'iy tanlanishga uchragan iqtisodiy qimmatli allellarning nasl -nasabini aniqlash uchun populyatsiyaning genetik tahlilining kuchini ko'rsatadi.

1800 va 1914 yillar oralig'ida sodir bo'lgan poygadagi katta o'zgarishlar (44 -havola) zotli ot poygasida tezlik va tezlik uchun kuchli tanlovni davom ettirdi. Bunday tendentsiyalar MSTNC-allelining ko'payishiga va saqlanishiga yordam berdi, bu tezlikka moyillik beradi. Chorvachilik va selektsiya qarorlariga genetik ma'lumotlarning kiritilishi tobora oqil zotli sanoatda qabul qilinmoqda va bu ma'lumot oqil populyatsiyadagi xilma -xillikni shakllantirishda davom etadi. Muhimi, MSTNdagenetik xilma -xilliknibilishlokus - bu jismoniy zot uchun optimal poyga masofasini aniqlash bilan teng, boshqa genomik lokuslarda qulay allellarning kombinatsiyasi ular mos keladigan masofada ustunlikka ega bo'lgan shaxslarni farqlash uchun muhim bo'ladi.

Usullar

Zamonaviy namunalardan DNK izolyatsiyasi

Genotiplash uchun namunalar 1990-yillarning o'rtalaridan boshlab yig'ilib laboratoriya omborlarida saqlangan. N =uchun zotdor bo'lmagan ot genotiplari aniqlandi22 populyatsiyadan 526 ot. Chorvachilikka qo'shilgan hissalar asosida genotiplash uchun 17 ta zotli bo'lmagan ot populyatsiyasi tanlangan (Britaniya orollari-Konnemara, Tog'li, Shetland 1, Shetland 2; Yaqin Sharq va Shimoliy Afrika-Axal-Teke, Anatoliya, Misr arab, Fulani, Turkman) va ularning kelib chiqishi otlarni o'rgatishning geografik markazida (Osiyo - Oltoy, Mo'g'ul 1, Mo'g'ul 2, Mo'g'ul Gobi, Transbaikaliya, Tuva/Sibir, Tuva 1, Yoqut). To'rtta populyatsiya yozilgan oqilona ta'sir asosida tanlangan (frotcha trotter, irlandiyalik qoralama, chorak ot, standart zot) va geografik jihatdan ajratilgan populyatsiya (Islandiya) ham kiritilgan. Buyuk Britaniya va Irlandiya, Yangi Zelandiya, AQSh va Avstraliyada namuna olingan jami 330 elita zotli ot genotip qilingan.Agar otlar hech bo'lmaganda bitta guruhda (ulushda) yoki ro'yxatga olingan poygada g'olib bo'lganida, elita deb hisoblanar edi. Elita oqsoqollari eng yaxshi poyga masofasiga bo'linib, ular musobaqaning eng yuqori darajasidagi masofani aniqladilar. Bir xil darajadagi bir nechta poygada g'olib bo'lgan holatlar, eng qimmat poyga masofasi eng yaxshi poyga masofasi aniqlandi.

Genomik DNK yangi qon yoki soch namunalaridan olingan. Allen va boshqalargako'ra, DNK soch namunalaridan ajratilgan . 45 yoki standart fenol/xloroform usulining o'zgartirilgan versiyasi. DNK Nukleon HT Genomik DNK ekstraktsiyasi to'plami (GE Healthcare Life Sciences, Bukingemshir, Buyuk Britaniya) yoki Maxwell 16 avtomatlashtirilgan DNK tozalash tizimi (Promega, Madison, WI, AQSh) yordamida yangi qondan ajratilgan.

Tarixiy namunalardan DNK izolyatsiyasi

Tarixiy namunalardan olingan DNK (2 -jadval) Kembrij universiteti biokimyo bo'limi va McDonald arxeologik tadqiqotlar institutida ilgari e'lon qilingan 46 -protokollar asosida olingan va tahlil qilingan. Qisqacha aytganda, suyak namunalari uchun sirt olib tashlandi va kortikal suyak 300 seriyali Dremel burg'ulash moslamasi (Dremel UK; Uxbridge, Buyuk Britaniya) va/yoki Certiprep SPEX Freezer/Mill (SPEX SamplePrep, Stanmore, Buyuk Britaniya) yordamida yig'ildi. Tish namunalari uchun ildiz olib tashlandi va Gilbert va boshqalarta'riflagan Dremel burg'ulash asbobi yordamida tojdan dentin yig'ildi.. 47 Har bir namuna uchun suyak yoki dentin kukuni (125-250 mg) yig'ilgan. Kontaminatsiyani oldini olish uchun namuna kukunga solingandan so'ng, boshqa namunadan to'qimalarni yig'ishdan oldin barcha uskunalar oqartuvchi, etanol va ultrabinafsha nurlar yordamida qayta sterilizatsiya qilindi.

Namunalar bir kecha-kunduzda, teskari o'girilib, 37% C da 0,5% w/v n-lauril sarkozin, 0,1 M EDTA (pH 8,0), 0,1 mg proteinaz K (Sigma-Aldrich Company Ltd.) o'z ichiga olgan 1 ml ekstraksiya buferida hazm qilindi. Dorset, Buyuk Britaniya) va 0,142% w/v fenatsiltiazolium brom eritmasi (Prime Organics, Woburn, MA, AQSh). Tozalash Kalmar va boshqalartomonidan berilgan tartibda amalga oshirildi. 48 Har bir namuna uchun 250 ml alikvotlar -80 ° C da 30 minut davomida 500 ml 96% etanol, 250 ml 4.0 M ammoniy asetat va 3.0 mkg ko'k dekstran yordamida etanol cho'kindi. Shundan so'ng, cho'kma hosil bo'lgan DNK va ko'k dekstran 3-4 minutda 13000 rpmda 30 daqiqa pelletlanadi, suvli faza olib tashlanadi va granulalar 20 ml ikki marta distillangan suvda, pH 8.0 da qayta to'xtatiladi. Ekstraktlar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga binoan QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Ltd., Crawley, Buyuk Britaniya) yordamida tozalanadi, bundan tashqari, oxirgi tozalash bosqichi 30 va 20 mkl elüsyon tamponining ikkita eritmasi bilan almashtiriladi.

Qadimgi DNK autentifikatsiyasining barcha tegishli mezonlari bajarildi 49, shu jumladan bir nechta boshqaruv elementlaridan foydalanish 50 va mustaqil institutda natijalarni takrorlash. Amplifikatsiya mahsulotlari DNKning shikastlanishi va ferment xatosi uchun bakterial klonlash 51 orqali baholandi.

Yagona SNP genotipi

Barcha zamonaviy namunalar g.66493737C/T SNP uchun Taqman kimyo yordamida StepOnePlus real vaqtda PCR tizimida (amaliy biosistemalar, Foster-Siti, Kaliforniya, AQSh) genotip qilingan. Tahlil primer 1: 5′-CCAGGACTATTTGATAGCAGAGTCA-3 ′, primer 2: 3′-GACACAACAGTTTCAAAATATTGTTCTCCTT-5 ′ va ikkita allelga xos bo'lgan lyuminestsent bo'yoqli etiketli problardan (VIC-AATGCACTAATCATAATCAATCATAATCAATCAATCAATAATCAATCAATAATCAATAATCAATAATCAATAATCAATAATCAATAATCAATAATCAATAATCAATAATCAATAATCATAATCAATAATCATAAATCAATAAATATTATTATTTKTKTKTTKTKTT-5 ') primer 1: 5'-CCAGGACTATTTGATAGGAGAGTCA-3 ", primer 2: 3'-GACACAACAGTTTCAAATATTGTTCTCCTT-5" va ikkita allelga xos floresan bo'yoq bilan belgilangan problardan iborat edi.

G.66493737C/T lokusidagi ketma-ketlik o'zgarishi 144-bp bo'lakning PCR kuchaytirilishidan so'ng va quyidagi primer ketma-ketlik yordamida joylashuvni o'z ichiga olgan tarixiy ekstraktlar uchun aniqlandi: 5′-CTACTCCAGGACTATTTGATAGCAGAG-3 ′ va 5′-TGCGATCAGTCTA ". PCRlar 17-19 mkl PLATINUM Taqo'z ichiga olgan 25 mkl reaktsiyalarda o'tkazildiYuqori aniqlikdagi Supermix, har bir primer 0,4–0,8 mkM, 8 × sigir zardobidagi albumin va 2–4 ​​mkl DNK ekstrakti. Genotiplash 5N-CTACTCCAGGACTATTTGATAGCAGAG-3 prim va 1 µl tozalangan DNK yordamida ilgari e'lon qilingan protokollar 41 bo'yicha SNaPshot Multiplex to'plami (Amaliy biosistemalar) yordamida amalga oshirildi. SNaPshot mahsulotlari ABI PRISM 3730 avtomatlashtirilgan genotipida elektroforezdan o'tkazildi. SNaPshot genotipi natijalari to'g'ridan -to'g'ri ketma -ketlik va kuchaytirish mahsulotlarining bir nechta klonlari ketma -ketligi bilan tasdiqlandi. Bu namunalarida genotipleme bu yondashuv ishonchliligi da heterozigot edi ko'p bo'lgan qayd palto rang fenotip to'g'ri aniqlash, namoyish etildi ASIPva MC1Rjoy 41. Mumkin bo'lgan DNK degradatsiyasi (masalan, C dan T ga o'tish lezyonlari) tufayli allelni tashlab ketishi natijasida paydo bo'lgan homozigotlarning noto'g'ri identifikatsiyasini nazorat qilish uchun biz genotip va yozilgan fenotip 41 bo'yicha palto rangini taqqoslaydigan mustaqil allelli testni o'tkazdik. ASIPva MC1Rpalto rang lokuslari uchun allellarning tushish tezligimos ravishda 21 va 26%ni tashkil etdi. O'qishni tashlab ketish tezligini hisobga olgan holda, uchta mustaqil genotiplash tajribasidan birida heterozigotlarni aniqlash ehtimoli 98%dan katta edi. Shunday qilib, biz har bir tarixiy zotli nasl uchun kamida uchta ekstraktdan kamida uchta PCR o'tkazdik. Tartiblar Clustal-W 53 algoritmi yordamida Mega 4-da (52-ref.) Va EquCab2.0 mos yozuvlar ketma-ketligi bilan taqqoslangan. Ushbu protsedura yana shuni ko'rsatadiki, tarixiy "Chilindor" namunalaridan aniqlangan ketma -ketliklar degradatsiyaning sezilarli darajada buzilmagan. MSTNlokusidan hosil qilingan ketma -ketliklar g.66493737C/T SNP yonidagi mos yozuvlar ketma -ketligi bilan to'liq mos edi.

Tarixiy ekstraktlar uchun genotiplash natijalari Dublin Trinity kollejida 54 o'rnatilgan protokollar yordamida yoki Dublin universitet kollejida StepOnePlus real vaqtda PCR tizimida Kembrij universitetida tayyorlangan DNK ekstraktlarining alikotlaridan olingan. Namunalarni genotiplash uchun tayyorlash hech qachon ot namunalarini tayyorlashda ishlatilmagan laboratoriyada amalga oshirildi.

Equine SNP50 BeadChips ma'lumotlari yordamida haplotipni qayta qurish

182 uchun genotiplar (C/C n= 102, T/T n= 80) Yaxshi zotli otlar EquineSNP50 Genotyping BeadChips (Illumina) yordamida genotiplangan 397 DNK namunasi namunasi uchun olingan ma'lumotlardan olingan. DNK ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Quant-iT PicoGreen dsDNA to'plamlari (Invitrogen, Carlsbad, CA, AQSh) yordamida aniqlandi va DNK kontsentratsiyasi 20 ng mkl -1 ga o'rnatildi. Genotiplash AROS Applied Biotechnology (Daniya) va GeneSeek (Linkoln, NE, AQSh) laboratoriyalari tomonidan amalga oshirildi. Ushbu tadqiqot uchun genotiplangan namunalar uchta alohida partiyada genotiplangan namunalar to'plami edi (1 -partiya, n =96; 2 -partiya, n =92; 3 -partiya, n)= 228). Biz sifatni nazorat qilish maqsadida 1 -partiya va 2 -partiya o'rtasida 4 juft takroriy namunani, 2 -partiya va 3 -partiya o'rtasida ikkita qo'shimcha juftlik namunasini va 3 -partiya ichida ikki juft takroriy namunani kiritdik va ularning ettitasida 99,9% dan ko'proq muvofiqlikni kuzatdik. sakkiz juft. Ota -ona triosi ham SNPlarning Mendel orqali uzatilishini tekshirish uchun kiritilgan. Biz 53,922 ta lokusni muvaffaqiyatli genotip qildik. Barcha namunalarda genotiplanish darajasi 90%dan yuqori edi. Bizning namunalarimizda genotiplashtirishning bajarilish darajasi

42 Shetland otlari uchun genotiplar EquineSNP50 Genotyping BeadChips (Illumina) yordamida yaratilgan ma'lumotlardan olingan. DNK ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Nanodrop (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE, AQSh) yordamida aniqlandi va DNK kontsentratsiyasi 60 ng ml -1 ga o'rnatildi. Genotiplash GeneSeek (Linkoln, NE, AQSh) tomonidan amalga oshirildi. Oltita ota -ona uchligi kiritilgan va sifatni nazorat qilish uchun ishlatilgan. Mendelni uzatish xatosi 99,8%dan kam edi. Biz 54602 ta lokusni muvaffaqiyatli genotip qildik va barcha namunalarda>93% (o'rtacha 97,4%) genotiplanish tezligi bor edi.

A ~ 2-Mb mintaqani yoyilgan SNP (BIEC2-417187-BIEC2-417520; bo'lib, ECA18: 65565128 BP-67457777 BP) ECA18 haqida o'z ichiga MSTNgenini ma'lumotlar olindi. Haploview 47 SNP (shu jumladan g.66493737C/T) orasidagi bog'lanish muvozanatining (LD) juftlik o'lchovlarini hisoblash uchun ishlatilgan va 55 ma'lumotlarining vizual tasvirini yaratish uchun ishlatilgan (1 -rasm). Standart usuldan foydalanib, mintaqa kuchli LD va kichik allel chastotalari>0,05 uchun ishonch oralig'iga asoslangan standart blok ta'rifi yordamida kuchli LD bloklariga bo'lindi.

Onlayn kazino
O'yin -kulgi avtomatlari
Onlaynkazino

Bizning yangiliklarimizga obuna bo'lish orqali birinchi eksklyuziv taklifni oling va eng yaxshi onlayn kazinolarda har kungi ajoyib chegirmalarimizdan foydalaning!